Para identificar uma bactéria se faz necessário obter informações sobre as características morfológicas, fisiológicas, bioquimicas e sorologicas e comparar as informações com um banco de dados de bactérias padrões.
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ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS
Identificar um dado organismo como espécie baseia-se
no preenchimento das características atribuídas àquela espécie. O
reconhecimento da fonte ou origem do espécime (ambiente, espécie animal, tipo
de patologia e localização) do organismo é às vezes fundamental para
identificação. A execução inadequada de um teste preliminar pode confundir e
prejudicar todo processo de identificação. Na rotina laboratorial são
utilizados certos testes chaves para reduzir o trabalho, o custo e abreviar o
tempo requerido para diagnóstico.
O processo de identificação
dos microrganismos é efetuado através da determinação de um número mínimo de
propriedades. Portanto, quanto menor o número de observações efetuadas, maior o
risco de erros de identificação. Usualmente é necessário utilizar organismos
como controles positivos e negativos para a execução de cada teste.
A correta caracterização
cultural do organismo em meios de isolamento primário, assim como a execução e
interpretação da coloração e reação ao Gram são vitais para esse sistema de
identificação. O período de incubação varia usualmente com o organismo que está
sendo isolado, mas a maioria dos organismos pode apresentar crescimento visível
após 48 horas. Para a atmosfera de incubação também se aplica o mesmo
princípio, i.e., para organismos aeróbios e anaeróbios facultativos utiliza-se
a atmosfera ambiente, e para o isolamento de microrganismos microaeróbios e
anaeróbios obrigatórios torna-se necessário obter a atmosfera adequada através
de métodos especiais, conforme visto no capítulo anterior.
O objetivo deste experimento é fornecer os
meios e métodos de semeadura, contagem, isolamento e identificação de
microrganismos encontrados no ambiente e processos infecciosos do homem e
animais. Desta forma, não pretende ser completo e, quando necessário, trará as
referências bibliográficas que o aluno deve consultar para obter informações
mais detalhadas.
Isolamento e características culturais
Após escolher ou receber o
espécime a ser estudado procede-se ao isolamento em meios sólidos apropriados.
Para exemplificar usaremos o ágar simples e uma cultura mista composta de
bactérias conhecidas. Para isolar o microrganismo efetua-se a inoculação ou
semeadura, utilizando a técnica do esgotamento do inóculo por estrias, tendo-se
o cuidado de usar inteiramente toda a área do meio para garantir a separação
das bactérias, de modo que após a incubação cada célula separada origine uma
colônia. Também são empregadas as técnicas de semeadura por disseminação com
alça de Drigalsky ou a técnica de pour-plate quando, além do isolamento,
pretende-se quantificar a população microbiana presente originalmente na
amostra.
O processo de identificação
propriamente dito começa com a observação das características das colônias
isoladas (a olho nu, com lupa ou microscópio, usando a objetiva de menor
aumento). Os seguintes critérios são utilizados para a caracterização colonial:
1. Forma -
punctiforme (até 1 mm de diâmetro); circular, com mais de 1 mm de diâmetro;
irregular; filamentosa; radiada, dentre outras;
2. Tamanho -
...em milímetros;
3.
Elevação -
achatada (alta, baixa), espraiada, convexa, umbilicada ou umbonada, mamilonada,
papilífera, etc.;
4.
Bordos -
inteiros, ondulados, lobados, denticulados, franjados, etc.;
2.
Superfície -
lisa, rugosa;
3.
Estrutura -
amorfa, granulosa, filamentosa;
4.
Caracteres
ópticos - opaca, translúcida e transparente;
5.
Cromogenia ou
Pigmentação - amarela, branca, preta, rósea, etc.;
Em outros meios podem ser
observadas outras características como hemólise (ágar Sangue), redução de
telurito (meio para corinebactérias, estafilicocos), fermentação de açúcares
(meio de MacConkey, ágar SS, dentre outros.
As características culturais
podem ser observadas também em meios líquidos e sólidos inclinados (em tubos).
As principais
características observadas em meio líquido são:
1. Tipo de
crescimento na superfície - sem crescimento,
película, grumosa, membranosa, anel (circular);
2. Opacidade ou
turvação - nula, ligeira ou suave, regular, intensa, transitória, persistente;
3. Cheiro -
nenhum, pronunciado, semelhante a ...;
4. Sedimento -
compacto, grumoso, viscoso, granular, escamoso, quantidade do sedimento
(abundante, escasso, nulo);
5.
Pigmentação.
As principais
características observadas em meio sólido inclinado são:
1. Crescimento -
nulo, escasso, abundante;
2. Pigmentação -
cor ....;
3. Lustro ou
brilho - fosco, luzidio;
4. Caracteres
ópticos - transparência, translúcido ou opaco;
5. Fluorescência
- positiva, negativa (em fonte de luz UV);
6. Consistência
- butirosa, viscosa, membranácea, quebradiça;
7. Emulsionabilidade
- nula, fácil, difícil;
8. Odor -
ausente, presente, semelhante a ....
Após a observação dessas
características devem ser feitos esfregaços para colorações especiais, para
observação da morfologia microscópica (forma, arranjos, tamanho e reação ao
Gram), presença ou ausência de esporos (forma e localização, com deformação ou
não do corpo bacteriano), flagelos (número e localização), cápsulas,
granulações metacromáticas (comum em corinebactérias) e coloração bipolar
(freqüente nas pasteurelas e yersinias). Também pode ser verificada a
motilidade por exame a fresco. A motilidade verdadeira consiste no deslocamento
do organismo em diferentes direções, não devendo ser confundido com o movimento
Browniano ou metabólico, i.e., o organismo vibra mas não se desloca. Os
procedimentos seguintes envolvem a caracterização metabólica, tolerância a
agentes químicos e físicos, a antimicrobianos e fagos (fagotipagem), bem como
propriedades antigênicas ou sorológicas e patogenicidade através da inoculação
em espécies animais susceptíveis (apropriadas).
METABOLISMO BACTERIANO (PROVAS BIOQUÍMICAS)
A investigação das
atividades metabólicas das bactérias “in vitro” é chamada de Provas Bioquímicas
e servem para auxiliar o microbiologista a identificar grupos ou espécies de
bactérias ou leveduras através da verificação das transformações químicas, que
ocorrem num determinado substrato, pela ação das enzimas de um dado
microrganismo. Como muitas vezes um determinado microrganismo possui um sistema
enzimático específico, promovendo transformação bioquímica específica, as
provas bioquímicas podem ser utilizadas na prática para a sua caracterização.
Para a realização das provas
bioquímicas é necessário utilizar meios de cultivo especiais contendo o
substrato a ser analisado e fornecer ao microrganismo as condições nutritivas e
ambientais necessárias ao seu desenvolvimento.
Objetivos: executar e
interpretar os resultados e as transformações metabólicas ocorridas em algumas
provas bioquímicas empregadas para identificação de bactérias.
As principais e mais
utilizadas provas bioquímicas são:
1. Produção de
catalase - Esta enzima atua sobre a
água oxigenada (peróxido de hidrogênio 3 a 5%) desdobrando-a em oxigênio e
água. A prova é feita colocando uma gota de solução aquosa de peróxido de
hidrogênio a 3-5% numa lâmina e, em seguida, com uma alça de platina, colocar
uma porção do crescimento bacteriano sobre a gota. Ou de outra forma,
adicionando-se 0,5 ml da mesma solução a uma cultura em meio líquido ou em ágar
inclinado. A prova é considerada positiva quando há borbulhamento ou
efervescência devido à liberação do oxigênio. A catalase é produzida por muitos
microrganismos e é usualmente empregada para diferenciar Staphylococcus, que
são catalase positivos de Streptococcus, catalase negativos, ou
os bacilos Gram positivos catalase negativos Lactobacillus e
Erysipelothrix de Listeria e a maioria dos Corynebacterium catalase
positivos.
2.
Prova da
citocromo-oxidase - Este sistema
enzimático está relacionado com os citocromos da cadeia respiratória de alguns
microrganismos. A prova consiste em colocar uma gota do reagente incolor tetrametil
p-fenileno de amina, recém preparado e protegido da luz, em um papel de filtro.
Em seguida, várias colônias do microrganismo em estudo são espalhadas sobre a
área do papel de filtro contendo o reagente, utilizando uma alça de platina ou
um bastão de vidro. A prova é considerada positiva quando na mistura do
reagente com a massa bacteriana desenvolve-se a cor púrpura em até 1 minuto. Na
reação negativa não há desenvolvimento de cor púrpura. As enterobactérias são
oxidase negativas e podem ser diferenciadas de outros bacilos Gram negativos. A
prova pode ser feita também em culturas em meios sólidos, adicionando-se o
reagente oxalato de p-aminodimetilanilina. A reação inicia-se com o
desenvolvimento de cor rósea, marrom e finalmente uma coloração negra na
superfície das colônias é indicativa da produção de citocromo-oxidase,
representando um teste positivo. O teste é negativo se não ocorrer alteração da
cor ou houver o desenvolvimento de uma cor rósea pálida.
3.
Utilização
do citrato como única fonte de carbono
- Alguns microrganismos como a E. coli
não possuem a permease do citrato, que faz o transporte do citrato para o
interior da célula, não conseguindo portanto crescer no meio contendo como
única fonte de carbono o citrato, embora possuam as enzimas, intracelulares,
que degradam o citrato. A prova é feita semeando-se a bactéria no meio sólido
inclinado de citrato de Simmons, contendo azul de bromotimol como indicador, o
qual em pH 6,8 a 7,0 apresenta-se verde. A prova positiva resulta no transporte
do citrato pela permease e a sua utilização pela enzima citratase resulta na
formação de oxaloacetato e acetato. O consumo do citrato induz a clivagem do
fosfato de amônia, alcalinizando o meio. Também, com o metabolismo do citrato
há formação de carbonatos que alcalinizam o meio, de modo que a cor do
indicador vira para azul. Na prova negativa o meio não se altera pois não há
crescimento microbiano. Por esse motivo a inoculação deve ser feita com agulha
e em linha reta para não haver influência de ingrediente do meio de onde se
originou a cultura, dando resultados falso-positivos.
4. Prova da produção de urease - A urease é uma enzima que degrada a uréia em duas
moléculas de amônia e uma de anidrido carbônico. A prova consiste em transferir
uma porção do crescimento bacteriano com uma alça para o meio contendo uréia,
pH neutro e um indicador de pH, o vermelho fenol. Após o crescimento a prova é
revelada positiva quando a urease ataca a uréia alcalinizando o meio que toma a
coloração rosa choque. Na prova negativa não há alteração da cor do meio. Os
organismos do gênero Proteus são urease positivos diferentemente da
maioria das enterobactérias.
4.
Prova da
produção de indol - O indol é
resultante da degradação do aminoácido triptofano pela enzima triptofanase. A
prova é realizada inoculando-se o meio contendo excesso de triptofano. Após a
incubação colocar 0,5 ml do reagente de Kovac ou o reativo de Ehrlich (solução
aquosa ou alcoólica de p-dimetil aminobenzaldeído, respectivamente) através da
parede interna do tubo. A prova é positiva quando na porção superior, i.e. na
interface da cultura e o reagente, desenvolve-se um anel de cor rósea dentro de
no máximo 5 minutos. Este resultado é devido à complexação do indol com o
aldeído, em meio ácido, formando o composto colorido. A prova é negativa com
qualquer outra tonalidade de cor (original do meio ou marrom)
5. Prova da produção de gás
sulfídrico ou sulfeto de hidrogênio –
Existem duas vias fermentativas principais através das quais alguns
microrganismos podem produzir sulfeto de hidrogênio. Pela primeira via, o gás
sulfídrico é produzido por redução do enxofre orgânico presente no aminoácido
cisteína (reação de hidrogenação), o qual é um componente das peptonas contidas
no meio. Essas peptonas são degradadas pelas enzimas microbianas a aminoácidos.
Através da ação da enzima desulfurase da cisteína o aminoácido cisteína
perde o átomo de enxofre, que por sua vez é reduzido pela adição de hidrogênio
da água para formar o gás sulfeto de hidrogênio, conforme ilustrado abaixo. Uma
tira de papel de filtro impregnada com solução saturada de acetato de chumbo é
colocada suspensa sobre o meio contendo o aminoácido sulfurado. Esteriliza-se o
meio, inocula-se com a cultura teste e incuba-se apropriadamente. Na prova
positiva, o H2S produzido é volátil e incolor, mas ao reagir com o
acetato de chumbo forma-se sulfeto de chumbo, que enegrece a extremidade do
papel de filtro. Na prova negativa a fita permanece branca.
Pela segunda via, o gás
sulfídrico também pode ser produzido pela redução de compostos inorgânicos de
enxofre tais como o tiossulfato, sulfato ou sulfito. Os microrganismos capazes
de produzir a enzima redutase do tiossulfato convertem o tiossulfato em sulfito
com liberação de sulfeto de hidrogênio. Os átomos de enxofre atuam como
aceptores de hidrogênio durante a oxidação do composto inorgânico conforme
abaixo. Para esse teste pode ser empregado o meio de TSI (tríplice sugar and
iron) ou o de meio de SIM (sulfito, indol e motilidade). Utilizando o meio de
SIM, que tem o tiossulfato como fonte de enxofre e o sulfato ferroso como
indicador da produção de sulfeto de hidrogênio. O meio é semi-sólido para
permitir a respiração anaeróbia. Nesse caso, inocula-se o meio por punctura e
incuba-se em aerobiose por 24h a 35oC.
Nas duas vias, o sulfeto de
hidrogênio produzido reage com o metal pesado formando sulfetos que apresentam
coloração negra.
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6. Prova da fermentação de
carboidratos - Esta prova pode ser
realizada de várias maneiras. A mais usual envolve a utilização de um meio com
glicose ou outro açúcar e/ou álcool com pH neutro e um indicador de pH
(Indicador de Andrade, púrpura de bromocresol). Além disso utiliza-se um tubo
de Durham, invertido, imerso no meio. O meio é inoculado com a cultura teste e
incubado. A prova positiva é indicada pela viragem da cor do meio de incolor
com Indicador de Andrade ou púrpura com púrpura de bromocresol, para vermelho ou amarelo,
respectivamente, devido a produção de ácidos, com abaixamento do pH do meio.
Além disso, se a bactéria possuir o sistema enzimático
hidrogênio-fórmico-liase, o ácido fórmico é transformado em C0² e Hidrogênio, os quais são coletados pelo tubo
de Durham, expulsando o meio e ficando a extremidade superior desse tubo
transparente, cheia dos gases citados. A prova negativa é
revelada pela ausência de
mudança de cor ou até mesmo pela acentuação da cor púrpura quando o reativo é o
púrpura de bromocresol, indicando utilização dos aminoácidos, com alcalinização
do meio. Deve-se lembrar que, para produzir esse meio bem como aquele usado
para pesquisa da produção de urease, os açúcares e a uréia devem ser
esterilizados previamente por filtração e, posteriormente, colocados
assepticamente no meio básico. Enterobactérias produzem ácido e gás da glicose
(exceto Shigella, que só produz ácido). As pseudomonas não fermentam
carboidratos. Algumas vezes é necessário verificar se a bactéria produz vários
ácidos (fermentação ácido mista), comum para E. coli, através do teste
chamado de vermelho de metila (VM) ou se apresenta fermentação
butileno-glicólica revelada pela detecção de acetoína através do teste
conhecido como VP ou Voges-Proskauer, comum em Enterobacter, mas não em
E.coli, permitindo diferenciar essas bactérias muito parecidas biológica e
bioquímicamente.
7.
Prova do
Vermelho de metila (VM) – prova
efetuada para determinar a capacidade do microrganismo de oxidar a glicose com produção e
estabilização de altas concentrações de produtos finais ácidos. Serve para
diferenciar organismos entéricos, em particular E. coli de E. aerogenes
 |
9.
Redução de
nitratos
11.
Prova da Motilidade - A prova da
motilidade indica indiretamente a produção de flagelos. Não é uma prova bioquímica
e sim fisiológica, mas auxilia a identificar bactérias. A prova é efetuada
inoculando-se em linha reta, através da técnica da punctura (com agulha), 2/3
de um meio semi-sólido. A prova indica motilidade quando os microrganismos
crescem deslocando-se da linha de inoculação, turvando o meio. A prova é
negativa quando os microrganismos ficam restritos ao local da inoculação sem,
contudo, turvar o meio.
As
provas bioquímicas são utilizadas rotineiramente para identificar
enterobactérias como E. coli, Salmonella, Shigella, Yersinia, dentre
outras. A diferenciação dos gêneros da familia Enterobacteriaceae é feita
através de provas bioquímicas ao passo que a diferenciação das espécies ou
tipos é feita sobretudo com base em caracteres sorológicos (sorotipos), embora
também possa ser baseada em caracteres bioquímicos ou na combinação de ambos.
Finalmente, certos sorotipos podem subdividir-se bioquimicamente constituindo
os biotipos ou então serem agrupados em lisotipos (fagotipos) de acordo com
suas reações frente a bacteriófagos específicos (Fagotipagem).
Para identificar um
determinado microrganismo, a rotina bacteriológica consiste da coleta adequada
da amostra e sua semeadura em meios de cultura (enriquecimento e meios
seletivos diferencias, se necessário). As colônias suspeitas serão semeadas em
determinados meios chamados de triagem (p/ identificação preliminar, p.ex.
TSI, LIA, Kliger, dentre outros), i.e., que oferecem concomitantemente
várias informações de natureza bioquímica, permitindo estabelecer um diagnóstico
presuntivo imediato. A depender dos resultados obtidos nesses meios de triagem
pode-se caracterizar imediatamente alguns grupos através de provas sorológicas
(aglutinação em lâmina) ou proceder a sua identificação bioquímica,
complementada pela tipificação sorológica quando necessário.
O meio de TSI fornece
uma série de reações bioquímicas que dão uma visão geral do metabolismo
bacteriano. Por esse motivo, vamos apresentar esse meio e as transformações que
ocorrem. O TSI ou tríplice açúcar e ferro é um meio sólido distribuído de tal
sorte que apresenta uma base e uma inclinação. É constituído de glicose (0,1%),
lactose (1,0%) e sacarose (1,0%), peptonas, aminoácidos, incluindo sulfurados,
tiossulfato de sódio e citrato férrico amoniacal (indicador da produção de H2S),
com pH neutro e um indicador de pH, o vermelho de fenol. O meio é semeado com
agulha por punctura na base e estrias na superfície. Após o crescimento da
bactéria pode-se observar os seguintes resultados: A bactéria não fermenta
qualquer dos açúcares, ficando inalterado o meio, ou até mesmo utiliza
os aminoáçidos respirando-os com produção de aminas que alcalinizam o
meio; fermenta somente a glicose de tal sorte que os ácidos
formados mudam o pH do meio apenas na base, que se torna amarela e a
inclinação vermelha por utilização dos aminoácidos (por respiração), alcalinizando
a mesma e neutralizando a pequena quantidade de ácidos, pois a concentração de
glicose é baixa - assim o resultado é expresso como K/A (inclinação alcalina e base
ácida); fermenta a lactose ou a sacarose com viragem do indicador de
todo o meio para amarelo, tanto a base como a inclinação permanecem ácidas,
pois os álcalis produzidos na inclinação são facilmente neutralizados pela
grande quantidade de ácidos produzidos na base, tendo em vista que a
concentração desses açúcares é dez vezes maior que a da glicose - o
resultado é expresso como A/A (inclinação e base ácidas). Nos dois últimos
casos, existe a possibilidade de detectar gases resultantes da
degradação do ácido fórmico em hidrogênio e anidrido carbônico, se a bactéria
possuir o sistema hidrogênio fórmico liase - os gases são indicados ou
visualizados indiretamente por levantar ou fragmentar o meio - o resultado é
representado como A/A com gás. Há também a possibilidade da bactéria produzir
H2S por respirar anaerobiamente o tiossulfato, captando elétrons
através da tiossulfato redutase, resultando em gás sufídrico e sulfito. O
sulfeto de hidrogênio na presença de sais de ferro forma sulfeto ferroso,
originando um precipitado negro insolúvel - dessa forma o resultado é dado
como A/A com gás e H2S.
Desse modo, pode-se observar
num único meio os processos fermentativos, respiração aeróbia e anaeróbia. A
utilização dos açúcares e aminoácidos na inclinação se dá apenas por respiração
aeróbia, enquanto que na base os processos são realizados por fermentação
(incluindo também putrefação, quando da utilização dos aminoácidos básicos,
sulfurados, triptofano, com produção de gás sulfídrico, mercaptanas, aminas,
dentre outras). Já a utilização do tiossulfato é ocorre por respiração
anaeróbia, gerando também gás sulfídrico.
